Η Εθνική Πινακοθήκη ιδρύθηκε στις 10 Απριλίου 1900 με νόμο ο οποίος προέβλεπε και θέση εφόρου του Ιδρύματος. Στη θέση αυτή διορίστηκε ο γνωστός ζωγράφος Γεώργιος Ιακωβίδης. Στις 28/6/1900 θεσμοθετήθηκε και ο κανονισμός λειτουργίας της. Οι πρώτες συλλογές της προέρχονταν από το Πολυτεχνείο και το Πανεπιστήμιο. Σ’ αυτές προστέθηκαν αμέσως μετά σημαντικές δωρεές. Σήμερα η Εθνική Πινακοθήκη περικλείει στις συλλογές της περισσότερα από 20.000 έργα ζωγραφικής, γλυπτικής, χαρακτικής και άλλων μορφών τέχνης και αποτελεί το θησαυροφυλάκιο της νεότερης ελληνικής καλλιτεχνικής δημιουργίας, καλύπτοντας μια περίοδο από τα μεταβυζαντινά χρόνια ως τις μέρες μας. Διαθέτει επίσης μία αξιόλογη συλλογή δυτικοευρωπαϊκής ζωγραφικής. Το 1954 η Εθνική Πινακοθήκη συγχωνεύτηκε με το κληροδότημα Αλεξάνδρου Σούτσου απ’ όπου προέρχεται και η διπλή της ονομασία.
Η Εθνική Πινακοθήκη-Μουσείο Αλεξάνδρου Σούτσου είναι Νομικό Πρόσωπο Δημοσίου Δικαίου και διοικείται από εννεαμελές Διοικητικό Συμβούλιο. Ο Πρόεδρος εκλέγεται από τα μέλη. Ο Διευθυντής, που έχει την ευθύνη του καλλιτεχνικού και μουσειολογικού προγραμματισμού, διορίζεται από τον Υπουργό Πολιτισμού με πενταετή θητεία, που μπορεί να ανανεώνεται. Το Μουσείο διαθέτει τρεις διευθύνσεις: α) τη Διεύθυνση Διοικητικού-Οικονομικού β) τη Διεύθυνση Συλλογών και γ) τη Διεύθυνση Συντήρησης, με τρεις διευθυντές επικεφαλής. Το Μουσείο έχει περίπου 80-90 υπαλλήλους μόνιμους και έκτακτους. Μισθοί και ανελαστικές δαπάνες λειτουργίας καλύπτονται από κρατική επιχορήγηση. Έσοδα από κληροδοτήματα καλύπτουν συγκεκριμένες ανάγκες: π.χ. το κληροδότημα Σούτσου καλύπτει μόνο κτιριακές δαπάνες, εμπλουτισμό της βιβλιοθήκης και αγορές παλαιών έργων τέχνης (οι δημιουργοί πρέπει να έχουν αποβιώσει τριάντα χρόνια πριν). Προτάσεις για αγορές και εκθέσεις υποβάλλει η πενταμελής καλλιτεχνική επιτροπή, που συγκροτείται από τον Διευθυντή και τέσσερα μέλη του Δ.Σ. με την εγγύτερη σχέση με το αντικείμενο. Την ευθύνη του καλλιτεχνικού προγραμματισμού έχει ο Διευθυντής.
Ο θεσμικός ρόλος της Εθνικής Πινακοθήκης είναι η συλλογή, διαφύλαξη, συντήρηση, μελέτη και εκθέση έργων τέχνης, με σκοπό την αισθητική καλλιέργεια του κοινού, την δια βίου εκπαίδευση μέσα απο την τέχνη και την ψυχαγωγία που αυτή προσφέρει, αλλά και την αυτογνωσία των Ελλήνων με τη βοήθεια της ιστορίας της τέχνης, η οποία εκφράζει σε συμβολικό επίπεδο τον εθνικό βίο.
Στην οργάνωση, τη λειτουργία, στον εμπλουτισμό των συλλογών της, στην εξεύρευση λύσης για την οριστική της στέγαση συνέβαλαν οι διαδοχικοί διευθυντές της και ιδιαίτερα ο Ζαχαρίας Παπαντωνίου (1918-1940), που διαδέχτηκε τον Γεώργιο Ιακωβίδη, διακεκριμένος κριτικός τέχνης και συγγραφέας, εμπλούτισε τις συλλογές της Πινακοθήκης με σημαντικά έργα Ελλήνων καλλιτεχνών μεταξύ των οποίων συγκαταλέγεται η Συναυλία των Αγγέλων του Δομήνικου Θεοτοκόπουλου, που αγοράστηκε το 1931 σε δημοπρασία στο Μόναχο, έναντι του σημαντικού ποσού των 5.900.000 δρχ. που κατέβαλλε το ελληνικό κράτος.
Σ’ όλη τη διάρκεια του πολέμου οι θησαυροί της Πινακοθήκης παρέμεναν κρυμμένοι στο Αρχαιολογικό Μουσείο απ’ όπου τους παρέλαβε ο Μαρίνος Καλλιγάς που διορίστηκε διευθυντής το 1949. Ο Μαρίνος Καλλιγάς, ιστορικός τέχνης και βυζαντινολόγος, ανέδειξε τα έργα της Πινακοθήκης οργανώνοντας εκθέσεις στο Ζάππειο, εμπλούτισε τις συλλογές της με σημαντικές αγορές, κατάφερε να εντάξει στο Μουσείο το πλούσιο κληροδότημα του Αλέξανδρου Σούτσου και έδωσε τελικά λύση στο χρόνιο στεγαστικό του πρόβλημα με την εξεύρεση του οικοπέδου και την ανέγερση του νέου κτιρίου με σχέδια των αρχιτεκτόνων Παύλου Μυλωνά και Δημήτρη Φατούρου. Το κτίριο, που είχε θεμελιωθεί το 1964, ολοκληρώθηκε και εγκαινιάστηκε το 1976 από τον νέο διευθυντή Δημήτρη Παπαστάμο, που διορίστηκε τον Δεκέμβριο του 1972. Στη διάρκεια της θητείας του εκτέθηκαν οι μόνιμες συλλογές στις νέες κτιριακές εγκαταστάσεις, οργανώθηκαν σημαντικές εκθέσεις Ελλήνων και ξένων καλλιτεχνών, πραγματοποιήθηκαν σημαντικές αγορές και δωρεές έργων τέχνης και ιδρύθηκε το παράρτημα της Κουμανταρείου Πινακοθήκης Σπάρτης.
Ο Δημήτρης Παπαστάμος φρόντισε για την οργάνωση της Πινακοθήκης και την στελέχωση του επιστημονικού προσωπικού της.
Από το 1992 μέχρι το 2022 διευθύντρια της Εθνικής Πινακοθήκης διετέλεσε η Καθηγήτρια της Ιστορίας της Τέχνης Μαρίνα Λαμπράκη-Πλάκα. Στη διάρκεια της θητείας της οργανώθηκαν μια σειρά από επιτυχημένες εκθέσεις Ελλήνων και ξένων καλλιτεχνών, μονογραφικές και θεματικές, που κατάφεραν να προσελκύσουν το ευρύ κοινό και να εδραιώσουν την Πινακοθήκη στη συνείδηση του κόσμου (πέντε εκατομμύρια επισκέψεις από το 1992). Με προσωπικές ενέργειες εξασφάλισε τη γενναιόδωρη και ζωτικής σημασίας στήριξη χορηγών, που κάλυψαν το 70% του προϋπολογισμού των δράσεων του μουσείου.
Το 2000 η Εθνική Πινακοθήκη-Μουσείο Αλεξάνδρου Σούτσου γιόρτασε τα 100 της χρόνια. Η ιστορική αυτή επέτειος σηματοδοτήθηκε με τα λαμπρά εγκαίνια της νέας παρουσίασης των μονίμων συλλογών του μουσείου στους ανακαινισμένους εσωτερικούς χώρους που πραγματοποιήθηκε με χορηγία του Ιδρύματος «Σταύρος Σ. Νιάρχος». Οι μόνιμες συλλογές παρουσιάσθηκαν με σύγχρονη μουσειολογική άποψη που παρακολουθεί την παράλληλη εξέλιξη τέχνης και κοινωνίας. Με το πρόγραμμα «Κοινωνία της Πληροφορίας» τα έργα των συλλογών ψηφιοποιήθηκαν και καταγράφηκαν ηλεκτρονικά. Η Ε.Π.Μ.Α.Σ. έχει αναπτύξει τα τελευταία χρόνια μεγάλη εκδοτική δραστηριότητα σε έντυπη και σε ψηφιακή μορφή με οδηγούς των συλλογών της, με σημαντικούς επιστημονικούς καταλόγους που συνοδεύουν τις εκθέσεις και με παιδαγωγικά βιβλία για νέους.
Η Εθνική Πινακοθήκη-Μουσείο Αλεξάνδρου Σούτσου, με σκοπό να επεκτείνει τη δράση και τον παιδαγωγικό της ρόλο και στην περιφέρεια, πρόσθεσε στην προϋπάρχουσα Κουμαντάρειο Πινακοθήκη Σπάρτης δύο ακόμη παραρτήματα: στην Κάτω Κορακιάνα της Κέρκυρας,το 1993, και στο Ναύπλιο, το 2004, σε κτίριο που παραχώρησε ο δήμος Ναυπλίου με πρωτοβουλία του Προέδρου του Δ.Σ. της Ε.Π.Μ.Α.Σ. κ. Απόστολου Μπότσου, και το οποίο ανακαινίστηκε και εξοπλίστηκε μουσειολογικά από το Κοινωφελές Ίδρυμα«Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης».
Στην έμπνευση και στις προσπάθειες της διευθύντριας Μαρίνας Λαμπράκη-Πλάκα οφείλεται και η ίδρυση της Εθνικής Γλυπτοθήκης, που λειτουργεί από το 2004 στο Άλσος Στρατού στην περιοχή Γουδή και στεγάζει την ιστορία της νεότερης ελληνικής γλυπτικής, φιλοξενώντας συγχρόνως και περιοδικές εκθέσεις. Το Ίδρυμα Σταύρος Νιάρχος χρηματοδότησε τόσο τις μελέτες για τον εκσυγχρονισμό των δυο διατηρητέων κτιρίων των παλαιών βασιλικών στάβλων του ιππικού όσο και την παρουσίαση των συλλογών γλυπτικής σε ένα από τα δίδυμα κτίρια και σε υπαίθριο χώρο έξι στρεμμάτων. Η ανακαίνιση πραγματοποιήθηκε με την ένταξη του έργου στο Γ΄ ΚΠΣ από το Υπουργείο Πολιτισμού.
Η Εθνική Πινακοθήκη-Μουσείο Αλεξάνδρου Σούτσου διαθέτει μια πλούσια βιβλιοθήκη με ανεκτίμητο αρχειακό υλικό και εξειδικευμένα εργαστήρια συντήρησης, εξοπλισμένα με τα πιο σύγχρονα συστήματα ανίχνευσης, μελέτης και αποκατάστασης έργων τέχνης. Διαθέτει επίσης ένα άξιο επιστημονικό, διοικητικό και φυλακτικό προσωπικό, που καλύπτει με επάρκεια και αφιλοκερδή ζήλο τις απαιτητικές και πολύμορφες λειτουργίες ενός τόσο σημαντικού μουσείου.
Ύστερα από απόφαση του Δ.Σ. του Ιδρύματος Ευριπίδη Κουτλίδη, που επικυρώθηκε από το Εφετείο Αθηνών, η σημαντική ομώνυμη συλλογή νεότερης ελληνικής τέχνης συστεγάζεται πλέον με τις συλλογές της Εθνικής Πινακοθήκης. Στην Εθνική Πινακοθήκη περιήλθε επίσης το Ίδρυμα Χρήστου και Σούλης Καπράλου, με ολόκληρο το έργο του γλύπτη, το μουσείο του στην Αίγινα και ένα σημαντικό ποσό για την επέκτασή του (1.200.000). Άλλα μεγάλα κληροδοτήματα όπως της Φρόσως Ευθυμιάδη-Μενεγάκη και της Μπέλλας Ραφτοπούλου δωρήθηκαν επίσης στην Ε.Π.Μ.Α.Σ. τα τελευταία χρόνια. Μεγάλες δωρεές όπως του Γιάννη Μόραλη, του Νίκου Νικολάου, του Ιωάννη Αβραμίδη, του Παναγιώτη Τέτση, του Δημήτρη Μυταρά, του Αλέκου Φασιανού, του Δανιήλ, του Μολφέση και άλλων καλλιτεχνών εμπλούτισαν τις συλλογές της. Επίσης πραγματοποιήθηκαν σημαντικές αγορές έργων μεταξύ των οποίων δυο πίνακες του Δομήνικου Θεοτοκόπουλου. Τα τελευταία χρόνια προστέθηκαν στις συλλογές της Εθνικής Πινακοθήκης 3.000 περίπου έργα.
Με όλους αυτούς τους θησαυρούς, τη διαχείρησή τους, τις πολλαπλές δραστηριότητες και τις εκθέσεις, η Εθνική Πινακοθήκη ασφυκτιούσε. Η ανάγκη επέκτασης ήταν επιτακτική. Και πράγματι επί διευθύνσεως της καθηγήτριας Μαρίνας Λαμπράκη-Πλάκα, χάρις στη μέριμνα του Υπουργείου Πολιτισμού, το σχέδιο επέκτασης προχώρησε: οι προμελέτες έγιναν από τους αρχικούς αρχιτέκτονες του κτιρίου, από τα γραφεία των καθηγητών Παύλου & Κωνσταντίνου Μυλωνά και Δημήτρη Φατούρου, με χορηγία του Ιδρύματος “Μαρία Τσάκος”. Οι τελικές μελέτες οφείλονται στο γραφείο “Π. Γραμματόπουλος-Χρ. Πανουσάκης & Συνεργάτες, Αρχιτεκτονική ΕΠΕ” και “Δ. Βασιλόπουλος & Συνεργάτες Ε.Ε.” Η επέκταση προσθέτει 11.020 μ2 στο υπάρχον κτίριο.
Ο προϋπολογισμός του έργου ανέρχεται στα 45 εκ. €, εκ των οποίων τα 32 εκ. € καλύφθηκαν από το ΕΣΠΑ, από το ΥΠ.ΠΟ.Τ., ενώ τα υπόλοιπα 13 εκ. € αποτελούν την γενναιόδωρη συνεισφορά του Ιδρύματος Σταύρος Νιάρχος. Η νέα μορφή της Ε.Π.Μ.Α.Σ. είναι σύγχρονη, δυναμική, λειτουργική και ιδιαίτερα ελκυστική.